探針法支原體檢測試劑盒說明書

上海起發生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發實驗試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發生物自有品牌，打造優質的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產業鏈中的國產生物試劑品質關。未來讓每一個和我們一樣擁有民族情懷的企業，共同創世界優秀的中國生物制造企業，圓夢中國。

產品詳情

產品描述

《探針法支原體檢測試劑盒》具有支原體識別率、最高的檢測靈敏度、最高的檢測正確率、含內參對照 從而可以區分真陰性樣品和假陰性樣品等一系列優點，該方法被認為是支原體快速檢測的金標準。如果您實驗室 已經擁有（或者打算購買）熒光定量 PCR 儀，我們強烈推薦您選擇《探針法支原體檢測試劑盒》。

經測試，本公司開發的《探針法支原體檢測試劑盒》至少可以識別在體外細胞培養中曾經報道出現的 20 種支 原體，根據文獻報道，這些支原體基本上占污染細胞的支原體種類。具體如下：（1）M. hyorhinis、（2） M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、(11) M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、 (14) M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、 （20）Ureaplasma urealyticum（注：M.為 Mycoplasma 的縮寫；A.為 Acholeplasma 的縮寫）。

根據支原體 DNA 的 序列，本試劑盒可以識別 100 多種至今已發現的支原體，具有廣譜的識別能力。

產品組分

（1） 探針法溶液 1P：550 μL（50 次），含支原體和內參檢測用引物及熒光探針;

（2） 探針法溶液 2T：50 μL（50 次），酶溶液;

（3） 內參質粒 mycoIC2：500 μL;

（4） 去離子水：1.2 mL；

（5） 陽性支原體 DNA：50 μL。

使用方法

使用方法

待測樣品的前處理 為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養液樣品需要取自換液后培養 2-3 天且匯合度在 90% 左右的細胞培養液上清（貼壁細胞）。懸浮培養的細胞也需要在換液傳代后，讓細胞生長 2-3 天再取培養液進行檢 測。可以按照以下兩種方法之一進行樣品的前處理： 方法一：對樣品進行支原體 DNA 的提取。 很多樣品（比如：培養很多天的細胞上清、血清、血漿等）由于含有抑制 PCR 擴增的成分，如果樣品不進行 前處理而直接檢測，有可能導致 qPCR 擴增失敗（qPCR 結果：支原體通道和內參對照通道均無擴增曲線）。該類樣品建議客戶進行樣品 DNA 提取（或者離心清洗，見后文方法二）后，再進行檢測。提取 DNA 的過程有兩個作用：

（1）基本可以去除所有抑制 PCR 擴增的成分，保證后續定量 PCR 擴增的正常進行；

（2）具有濃縮支原體 DNA 的作用，可以提高相對檢測靈敏度 10-100 倍。 樣品 DNA 的提取推薦使用本公司的《支原體基因組 DNA 提取試劑盒》。不同樣品支原體基因組 DNA 的提取步驟，請參考本公司的《支原體基因組 DNA 提取試劑盒》的說明書。

方法二：樣品不經 DNA 提取（推薦方法。該方法不僅可以濃縮支原體從而提高相對檢測靈敏度，還可以去 除絕大部分可能的抑制物，PCR 擴增被抑制的可能性極低。如果該簡單一步離心清洗的方法仍然無法去除抑制 物，可以使用后文注意事項部分的三步離心清洗的方法。），具體方法如下：

（1）根據濃縮倍數，可以取 100 - 1500 μL 上述待測樣品到 1.5 mL 離心管內，在普通臺式離心機上 1000 rpm (大約 150 g)低速離心 5 minutes，將離心后的上清轉移到另一個離心管內，丟棄細胞沉淀。

（2）將上清繼續 13000 rpm（約 16000 g）高速離心 5 minutes，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉 淀，可以保留底部 3-5 μL 液體），用 50μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可以長期保存。推薦）或者去 離子水（樣品比較不穩定，只適合當天或短期內檢測使用）重懸沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻【如果最初使用了 1500 μL 的樣品，則支原體濃度大約提高了 30 倍】。

（3）往 50 μL 重懸后的樣品中加入 4 μL 內參質粒 mycoIC2【內參質粒融化后，請混勻后再吸取】。

（4）至此，該樣品可以直接進行檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩定）。熱 處理具體如下：95 ℃加熱處理 5 minutes（可以轉移到 PCR 管內，在 PCR 儀上進行加熱處理），簡單離心 （1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。 

實驗案例分析

陽性對照管：其 FAM 通道有典型的 S 型擴增曲線（即指數擴增），其 VIC 通道的擴增線呈直線或者S型曲線。

陰性對照管：其 FAM 通道的擴增線呈直線，其 VIC 通道應該有典型的 S 型擴增曲線。

如果陽性對照管、陰性對照管同時滿足上述條件，則說明本次實驗結果有效，否則實驗結果無效。典型的陰性直線型擴增線和陽性 S 型擴增曲線如圖 1 所示：

圖 1. 典型的陰性直線型擴增線（左）和陽性 S 型擴增曲線（右）

注意事項

1. 實驗全過程，應該佩戴一次性手套操作。

2. 如果出現qPCR的擴增被細胞的代謝產物抑制時（qPCR 結果：支原體通道和內參對照通道均無擴增曲線）， 可以采取以下幾種措施：

1) 將取樣的時間提前到換液后 2 天或 3 天，此時細胞上清的 PCR 擴增抑制物相對比較少，一般不會產生嚴重的抑制。據我們測試，換液后 5 天，PCR 擴增抑制物就已經大量積累。

2) 用 PBS 對待測樣品進行離心清洗，去除樣品中的抑制物。具體方法如下：取 1 mL 細胞上清，先 13000 rpm 離心 5 minutes，吸走 950 μL 上清；加 PBS 950 μL，再次離心，吸走 950 μL 上清；再加 PBS 950 μL， 第三次離心，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀，可以保留底部 3-5 μL 液體），用 50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理 5 minutes，簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。但是該方法有如下缺點：第一，如果樣品支原體含量較少，離心清洗可能導致漏檢，因為離心清洗過程中，可能導致支原體部分丟失。第二，個別樣品，即使經過上述清洗也無法去除抑制劑。

3) 使用支原體基因組 DNA 抽提試劑盒（推薦使用本公司《支原體基因組 DNA 提取試劑盒》），抽提細胞上清的支原體 DNA 后再進行 PCR 鑒定。

4) 使用本公司生產的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》或者《發光法支原體檢測試劑盒》進行檢測，經測試，未發現這兩種試劑盒會被細胞的代謝產物所抑制。

為了預防 PCR 的擴增被細胞的代謝產物抑制的問題，也可以考慮將所有待測樣品全部進行離心清洗或者DNA 提取后，再使用本試劑盒進行檢測。

3. 支原體檢測樣品可以分成兩類：第一類，用含血清的培養液培養的哺乳動物細胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長，培養數天后，支原體密度一般較高，可達10^7-9/mL，可以直接檢測。第二類，低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少，直接使用快速支原體檢測試劑盒進行檢測，往往檢測不出來。這些樣品建議：

（1）對樣品的支原體進行離心濃縮或者使用本公司《支原體基因組 DNA 提取試劑盒》將支原體 DNA 濃縮提取，該兩種方法大約可以將檢測靈敏度繼續提高 10-100 倍。該方法速度快，當天出結果，但是可靠性不如后面的培養法。

（2）使用支原體液體培養基（必須同時接種不含精氨酸和含精氨酸的兩種支原體液體培養基）培養3-7 天后，再進行檢測。具體方法請參考本公司《發光法支原體檢測試劑盒》說明書中最后的注意事項部分。該方法速度較慢，需要 3-7 天，但是可靠性高。