CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒說明書

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產(chǎn)品詳情

 產(chǎn)品描述

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 細(xì)胞活性檢測試劑盒是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性相關(guān)實驗的快速、高靈敏度檢測試劑盒。

CCK-8 的主要成分為水溶性四唑鹽[Water Soluble Tetrazolium-8] (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，Water Soluble Tetrazolium-8是一種類似于MTT 的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的水溶性的甲臜（Formazan，參考圖1)。

Water Soluble Tetrazolium-8被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶生物還原后生成的甲臜能夠直接溶解在培養(yǎng)基中。活細(xì)胞的數(shù)目越多，則顏色越深。對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。

圖1. Water Soluble Tetrazolium-8分子結(jié)構(gòu)及CCK-8檢測原理

產(chǎn)品特點

1.   MTT 法生成的甲臜不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機溶劑溶解；而CCK-8 產(chǎn)生的甲臜是水溶性的，省去了溶解步驟，因此減少了該操作步驟帶來的實驗誤差。

2.   由于CCK-8 產(chǎn)生的甲臜是水溶性的，無需吸掉培養(yǎng)基后，再用DMSO 等有機溶劑溶解，非常適合用于懸浮細(xì)胞的活性測定。

3.   與MTT 方法相比，CCK-8 法線性范圍更寬，靈敏度更高。

4.    CCK-8 法對細(xì)胞無毒性，可以多次測定，選取最佳測定時間。

5.    CCK-8 法無需配制，即開即用。

6.   CCK-8 法適合大規(guī)模、高通量的樣品檢測。

使用方法

使用方法

1.   在96 孔板中配制100 μL 的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 小時（在37℃，5% CO₂的條件下）。

2.    向培養(yǎng)板加入10 μL 的待測藥物進(jìn)行處理。

3.  根據(jù)實驗需要，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段時間 （例如：6, 12，24 或48 小時）。

注：如果不進(jìn)行藥物處理而直接測定細(xì)胞的活性，則不需要2-3 步驟，直接從第4 步操作。

4.    向每孔加入10 μL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響O.D 值的讀數(shù)）。

5.   將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2-4 小時。

6.   用酶標(biāo)儀測定在450 nm 處的吸光度。

7.   如果暫時不測定OD 值，可 以向每孔中加入10 μL 1% SDS（w/v） 溶液或者 0.1 M HCl 溶液，并蓋上培養(yǎng)板蓋子，在室溫條件下避光保存。24 小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

實驗案例分析

圖2. 本實驗結(jié)果證明：上海起發(fā)CCK8與同仁CCK8的測試效果幾乎相同。

注意事項

1.     由于96 孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，周圍一圈建議不用，改加PBS或水。

2.    CCK-8 檢測細(xì)胞活性的原理是通過檢測活細(xì)胞脫氫酶催化的反應(yīng)。如果待測體系中存在還原劑（例如一些抗氧化劑），可能會干擾檢測結(jié)果，需設(shè)法去除其影響。

3.  當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96 孔板時，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μL培養(yǎng)基)，且加入CCK-8后孵育的時間長一些。

4.   如果細(xì)胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，應(yīng)洗滌細(xì)胞更換培養(yǎng)基后再加CCK-8 檢測。

5.   酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除只含有培養(yǎng)基的對照孔中本底的吸光度而消除，因此不會對檢測結(jié)果造成影響。