簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)方法（實(shí)際操作步驟）
更新時(shí)間：2012-06-10 點(diǎn)擊次數(shù)：5567
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自己做過一些簡(jiǎn)并引物，現(xiàn)將我利用生物信息學(xué)資源設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的各個(gè)步驟作一個(gè)總結(jié)，各位戰(zhàn)友可將各自的心得體會(huì)寫下，以便大家交流！！！
一、利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列
因?yàn)槊艽a子的關(guān)系，不同的核酸序列可能表達(dá)的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條相關(guān)序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTp（通過蛋白查蛋白），在整個(gè)Nr數(shù)據(jù)庫中中查找與之相似的氨基酸序列。
二、對(duì)所找到的序列進(jìn)行多序列比對(duì)
將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，可選工具有Clustal W，也可在線分析[url][/url]http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 。其結(jié)果入下圖所示,所有序列的共有部分將會(huì)顯示出來。“*”表示保守，“：”表示次保守。
三、確定合適的保守區(qū)域
設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物至少需要上下游各有一個(gè)保守區(qū)域，且兩個(gè)保守區(qū)域相距50～ 400個(gè)aa為宜，使得pcr產(chǎn)物在150~1200bp之間，zui重要的是每一個(gè)保守區(qū)域至少有6個(gè)aa殘基，因?yàn)槊織l引物至少18bp左右。若比對(duì)結(jié)果保守性不是很強(qiáng)很可能找不到6個(gè)aa的保守區(qū)域，這時(shí)可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣相近的物種進(jìn)行二次比對(duì)，若保守性仍達(dá)不到要求，則需進(jìn)行三次比對(duì)。總之，究竟要選多少序列來比對(duì)，要根據(jù)前一次比對(duì)的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。zui終目的就是有兩個(gè)6個(gè)aa且兩者間距離合適的保守區(qū)域。
四、利用軟件設(shè)計(jì)引物
當(dāng)?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專業(yè)的軟件來設(shè)計(jì)引物了，其中pp5支持簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)（關(guān)于其的使用請(qǐng)見筆者的另一個(gè)帖子http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=8798113&sty=1），將參與多序列比對(duì)的序列中的任一條導(dǎo)入pp5中，再將其翻譯成核苷酸序列，有密碼子簡(jiǎn)并性，其結(jié)果是有n多條彼此只相差以個(gè)核苷酸的序列群，該群可用一條有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈來表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝ A／T，H＝ A／C／T，B＝ C／G／T，V＝A／C／G， D＝A/G /T,N=A／C／G/T），該具有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區(qū)域的對(duì)應(yīng)部分，在pp5中修改參數(shù)，令其在兩個(gè)距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對(duì)，總之要保證上下游引物都落在該簡(jiǎn)并鏈的保守區(qū)域內(nèi)，結(jié)果會(huì)有數(shù)對(duì)，分?jǐn)?shù)越高越好。
五、對(duì)引物的修飾
若得到的引物為：
5-NAGSGNGCDTTANCABK-3
則其簡(jiǎn)并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明顯該條引物的簡(jiǎn)并度多高不利于pcr。我們可以通過用次黃嘌呤代替N（因?yàn)榇吸S嘌呤能很好的和4種堿基配對(duì)）和根據(jù)物種密碼子偏好這兩種方法來降低簡(jiǎn)并度（有個(gè)查密碼子偏好的數(shù)據(jù)庫我以前發(fā)過大家搜索一下把）。
zui后，這樣子設(shè)計(jì)出來簡(jiǎn)并引物對(duì)，適用于用于比對(duì)的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。
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